VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望

doi:10.13304/j.nykjdb.2020.0781

摘要/Abstract

摘要：

随着作物基因组测序工作的陆续完成，大量影响作物重要农艺性状的基因功能等待挖掘。由于缺少高效的遗传转化方法，多种作物的基因功能研究进展缓慢。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing， VIGS）技术不依赖遗传转化，通过病毒载体接种即可在当代植物体内实现对靶向基因的沉默。VIGS技术因其起效时间快、沉默效率高、操作成本低、便于高通量和应用植物范围广等特点，被越来越多地应用于不同作物基因功能和代谢通路解析的反向遗传学研究中。介绍了VIGS的技术原理及其发展过程，系统归纳了VIGS在不同作物中的应用，总结和讨论了现有VIGS应用的局限性以及影响其沉默效率的几个关键因素，并对VIGS技术在未来植物生物学研究中的应用进行了展望，以期为VIGS技术的进一步应用和发展提供参考。

关键词: 病毒诱导的基因沉默, 病毒载体, 作物, 基因功能, 反向遗传学

Abstract:

With the completion of crop genome sequencing， a large number of genes' functions affecting important agronomic traits of crops are waiting to be discovered. Due to the lack of genetic transformation methods， the research on gene function of most crops is progressing slowly. Virus-induced gene silencing （VIGS） technology does not rely on genetic transformation. Through virus vector inoculation， efficient silencing of targeted genes can be achieved in contemporary plants. VIGS technology is increasingly used in reverse genetics for analysis of gene functions and metabolic pathways in different crops due to its fast onset time， high silencing efficiency， low operating cost， high-throughput and wide application of plants. This article introduced the technical principles and development process of VIGS， systematically summarized the application of VIGS in different crop research， and then summarized and discussed the limitations of existing VIGS applications and several key factors affecting its silence efficiency， and finally the application in future plant biology research was prospected， which would provide reference for its further application and development.

Key words: virus-induced gene silencing （VIGS）, viral vector, crop, gene function, reverse genetics

中图分类号:

Q943.2

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图/表 3

图1 RNAi与VIGS作用机制（以TRV为例）A：RNAi； B：VIGS。A-a： dsRNA被切割成siRNA；A-b：沉默效应复合体RISC的形成；A-c： RISC被激活；A-d： RISC与互补mRNA序列结合；A-e：目标基因mRNA降解。B-a：野生型TRV RNA1和RNA2基因组结构；B-b：人工改造后的pBINTRA6和pTV00T-DNA结构；B-c：植物细胞内的病毒免疫机制过程。MT—甲基转移酶；H—解旋酶； RdRp—NA依赖性RNA聚合酶； Mp—运动蛋白； 16 k—16 k蛋白； Cp—外壳蛋白； 29.4 k—29.4 k蛋白； 32.8k—32.8 k蛋白；LB—左同源臂； 35S—35S启动子；T—转录终止子； RB—右同源臂；MCS—多克隆位点。

Fig.1 Mechanism of RNAi and VIGS （taking TRV as an example）A：RNAi； B：VIGS。A-a： The dsRNA is cleaved into siRNAs； A-b： The formation of RISC； A-c： The RISC is activated； A-d： The RISC binds to complementary mRNA sequences； A-e： Target gene mRNA degradation. B-a： Genomic organization of wild-type TRV RNA 1 and RNA 2； B-b： The structure of pBINTRA6 and PTV00T-DNA after artificial modification； B-c： The process of viral immunity in plant cells. MT—Methyltransferase；H—Helicase； RdRp—RdRp gene； Mp—Movement protein； 16 k—16 kD protein； Cp—Coat protein； 29.4 k—29.4 kD protein； 32.8 k—32.8 kD protein；LB—Left border； 35S—35S promoter；T—Transcription terminator； RB—Right border；MCS—multiple cloning site.

表1 VIGS载体及其在植物中的应用

Table 1 VIGS vectors and their applications in plant

病毒

Virus

基因组

Genome

宿主

Natural host

基因研究

Genes studied

首次应用年份Year of first application

基因功能

Gene function

文献

Reference

烟草花叶病毒

Tobacco mosaic virus

RNA

烟草

N. tabacum

八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶

Phytoene synthase， phytoene desaturase

1995

类胡萝卜素生物合成

Biosynthesis of carotenoids

［5］

马铃薯X病毒

Potato virus X

RNA

马铃薯，烟草

S. tuberosum， N. tabacum

β-葡萄糖醛酸酶、八氢番茄红素去饱和酶 β-glucuronidase， phytoene desaturase

1998

硝酸还原酶活性

Nitrate reductase activity

［6-7］

番茄金色花叶病毒

Tomato goldenmosaic virus

DNA

番茄

S. lycopersicon

硫等位基因、荧光素酶

Sulfur allele， luciferase

1998

同源染色体基因表达调节

Regulation of homologous gene expression

［8］

烟草脆裂病毒

Tobacco rattle virus

RNA

宿主范围广泛

Wide host range

八氢番茄红素去饱和酶、绿色荧光蛋白、叶绿体CLA1基因等

Phytoene desaturase， green fluorescent protein， Cloroplastos CLA1， etc.

2001

抗病、棉花品质性状、耐寒、果实发育、线虫防治

Disease-resistant， quality character of cotton， chilling tolerance， fruit development， nematoda control

［9-14］

大麦条纹花叶病毒

Barley stripe mosaic virus

RNA

大麦、小麦、燕麦、玉米、甘蓝

H. vulgare，T. aestivum，

A. sativa，Z. mays，

B. oleracera

八氢番茄红素去饱和酶、绿色荧光蛋白Phytoene desaturase， green fluorescent protein

2002

抗病、胁迫

Disease-resistant， stress

［15-17］

卫星烟草花叶病毒

Satellite tobacco moscirevirus

RNA

木立烟草

N. glauca

八氢番茄红素去饱和酶、查尔酮合酶、ADP核糖聚合酶等

Phytoene desaturase， Chalcone synthase A， poly（ADP-ribose） polymerase， etc.

2002

花色性状

Character of flower color

［18］

白菜曲叶病毒

Cabbage leaf curl virus

DNA

拟南芥

A. thaliana

绿色荧光蛋白、八氢番茄红素去饱和酶Green fluorescent protein， phytoene desaturase

2002

叶绿素合成、DNA复制

Chlorophyll synthesis， DNA replication

［19］

非洲木薯花叶病毒

African cassava mosaic virus

DNA

树薯

M. esculenta

八氢番茄红素去饱和酶、硫等位基因Phytoene desaturase， sulfur allele

2004

细胞机制Cellular mechanism

［20］

表1 VIGS载体及其在植物中的应用

Table 1 VIGS vectors and their applications in plant

病毒

Virus

基因组

Genome

宿主

Natural host

基因研究

Genes studied

首次应用年份Year of first application

基因功能

Gene function

文献

Reference

烟草花叶病毒

Tobacco mosaic virus

RNA

烟草

N. tabacum

八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶

Phytoene synthase， phytoene desaturase

1995

类胡萝卜素生物合成

Biosynthesis of carotenoids

［5］

马铃薯X病毒

Potato virus X

RNA

马铃薯，烟草

S. tuberosum， N. tabacum

β-葡萄糖醛酸酶、八氢番茄红素去饱和酶 β-glucuronidase， phytoene desaturase

1998

硝酸还原酶活性

Nitrate reductase activity

［6-7］

番茄金色花叶病毒

Tomato goldenmosaic virus

DNA

番茄

S. lycopersicon

硫等位基因、荧光素酶

Sulfur allele， luciferase

1998

同源染色体基因表达调节

Regulation of homologous gene expression

［8］

烟草脆裂病毒

Tobacco rattle virus

RNA

宿主范围广泛

Wide host range

八氢番茄红素去饱和酶、绿色荧光蛋白、叶绿体CLA1基因等

Phytoene desaturase， green fluorescent protein， Cloroplastos CLA1， etc.

2001

抗病、棉花品质性状、耐寒、果实发育、线虫防治

Disease-resistant， quality character of cotton， chilling tolerance， fruit development， nematoda control

［9-14］

大麦条纹花叶病毒

Barley stripe mosaic virus

RNA

大麦、小麦、燕麦、玉米、甘蓝

H. vulgare，T. aestivum，

A. sativa，Z. mays，

B. oleracera

八氢番茄红素去饱和酶、绿色荧光蛋白Phytoene desaturase， green fluorescent protein

2002

抗病、胁迫

Disease-resistant， stress

［15-17］

卫星烟草花叶病毒

Satellite tobacco moscirevirus

RNA

木立烟草

N. glauca

八氢番茄红素去饱和酶、查尔酮合酶、ADP核糖聚合酶等

Phytoene desaturase， Chalcone synthase A， poly（ADP-ribose） polymerase， etc.

2002

花色性状

Character of flower color

［18］

白菜曲叶病毒

Cabbage leaf curl virus

DNA

拟南芥

A. thaliana

绿色荧光蛋白、八氢番茄红素去饱和酶Green fluorescent protein， phytoene desaturase

2002

叶绿素合成、DNA复制

Chlorophyll synthesis， DNA replication

［19］

非洲木薯花叶病毒

African cassava mosaic virus

DNA

树薯

M. esculenta

八氢番茄红素去饱和酶、硫等位基因Phytoene desaturase， sulfur allele

2004

细胞机制Cellular mechanism

［20］

图2 MIR?VIGS与HIGS技术机理A：MIR-VIGS； B：HIGS。A-a：人工合成miRNA并构建重组载体；A-b： miRNA前体经过切割后形成双链miRNA；A-c：沉默效应复合体RISC的形成；A-d： RISC被激活；A-e： RISC与互补mRNA序列结合；A-f：靶基因mRNA的降解。B-a：重组载体的构建；B-b：沉默效应复合体RISC的形成；B-c： RISC与互补mRNA序列结合；B-d：病原体mRNA降解，基因表达被抑制。

Fig.2 Mechamism of MIGS?VIGS and HIGSA：MIR-VIGS； B：HIGS.A-a： AmiRNA is synthesized and recombinant vectors are constructed； A-b： The pri-amiRNA is cleaved into dsmiRNAs； A-c： The formation of RISC； A-d： The RISC is activated； A-e： The RISC binds to complementary mRNA sequences； A-f： Target gene mRNA degradation； B-a： Construction of recombinant vector； B-b： RNA-induced silencing complex （RISC） is formed； B-c： RISC bind to the pathogen mRNA； B-d： The pathogen mRNA degrades and gene expression is inhibited.

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