基于RPA技术对转CP4-EPSPS基因产品的快速检测

doi:10.13304/j.nykjdb.2021.0785

中国农业科技导报 ›› 2023, Vol. 25 ›› Issue (2): 227-233.DOI: 10.13304/j.nykjdb.2021.0785

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基于RPA技术对转CP4-EPSPS基因产品的快速检测

胡秀文¹(), 邓波²(), 王金斌³, 刘华³(), 唐雪明⁴(), 王宇⁵, 曾海娟³, 蒋玮³, 李红⁶

^1.上海海洋大学食品学院，上海 201306
^2.上海市农产品质量安全中心，上海 201708
^3.上海农业科学院生物技术研究所，上海 201106
^4.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240
^5.兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州 730050
^6.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106

收稿日期:2021-09-07 接受日期:2021-10-20 出版日期:2023-02-15 发布日期:2023-05-17
通讯作者: 刘华,唐雪明
作者简介:胡秀文 E-mail：849727644@qq.com
邓波 E-mail：1307426015@qq.com第一联系人：胡秀文和邓波为共同第一作者。
基金资助:
上海市科技计划项目(21N31900800);上海市青年科技英才扬帆计划项目(20YF1443000);上海市科委自然科学基金项目(19ZR1436800);上海市农业科学院卓越团队计划项目（农科创2017-B-07）

Rapid Detection of CP4-EPSPS Transgenic Products Based on RPA Technology

Xiuwen HU¹(), Bo DENG²(), Jinbin WANG³, Hua LIU³(), Xueming TANG⁴(), Yu WANG⁵, Haijuan ZENG³, Wei JIANG³, Hong LI⁶

^1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China
^2.Shanghai Center of Agri-products Quality and Safety，Shanghai 201708，China
^3.Biotech Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China
^4.Shanghai Jiao Tong University School of Agriculture and Biology，Shanghai 200240，China
^5.School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China
^6.Institute of Animal Husbandry & Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China

Received:2021-09-07 Accepted:2021-10-20 Online:2023-02-15 Published:2023-05-17
Contact: Hua LIU,Xueming TANG

摘要/Abstract

摘要：

核酸检测在农产品安全检测中的应用十分广泛，随着转基因作物的商业化种植，迫切需要一种快速、特异、灵敏的转基因作物检测方法。利用重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）技术对含有转基因产品及其制品中CP4-EPSPS基因进行检测，共设计5对引物来筛取最佳引物，并对反应体系和反应温度进行优化。结果表明，该方法采用20 μL体系在37 ℃恒温反应15 min即可对CP4-EPSPS基因进行快速检测。该方法检测转基因的灵敏度阈值为45拷贝，灵敏度高、特异性强，为大规模筛查CP4-EPSPS基因提供了一种新的途径。

关键词: 重组聚合酶扩增, CP4-EPSPS, 转基因作物, 核酸检测

Abstract:

Nucleic acid detection is widely used in the safety detection of agricultural products. With the commercial cultivation of genetically modified crops， the method with rapid， specific and sensitive is an urgent need for the detection of genetically modified crops. The recombinase polymerase amplification （RPA） technology was used to detect CP4-EPSPS genes in genetically modified products and their products. Five pairs of primers were designed to screen the best pair of primers， and the reaction system and temperature were optimized. The results show that CP4-EPSPS gene could be quickly detected by this method with 20 μL reaction system， 15 min reacted at 37 ℃. The sensitivity threshold for detecting transgenic DNA was 45 copies with highly sensitive and specific nucleic， which provided a new way for large-scale screening of CP4-EPSPS gene.

Key words: recombinant polymerase amplification, CP4-EPSPS, transgenic crops, nucleic acid detection

中图分类号:

Q-33

胡秀文, 邓波, 王金斌, 刘华, 唐雪明, 王宇, 曾海娟, 蒋玮, 李红. 基于RPA技术对转CP4-EPSPS基因产品的快速检测[J]. 中国农业科技导报, 2023, 25(2): 227-233.

Xiuwen HU, Bo DENG, Jinbin WANG, Hua LIU, Xueming TANG, Yu WANG, Haijuan ZENG, Wei JIANG, Hong LI. Rapid Detection of CP4-EPSPS Transgenic Products Based on RPA Technology[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2023, 25(2): 227-233.

图/表 10

表1 试验材料

Table 1 Experimental materials

转基因作物 Genetically modified crop	名称 Name	CP4-EPSPS基因 CP4-EPSPS gene
转基因玉米 Transgenic maize	NK603	阳性 Positive
转基因大豆 Transgenic Soybean	MON89788	阳性 Positive
转基因棉花 Transgenic cotton	MON1445， MON88913	阳性 Positive
转基因油菜 Transgenic rapeseed	GT73	阳性 Positive
转基因苜蓿 Transgenic alfalfa	J101； J163	阳性 Positive
转基因甜菜 Transgenic beet	H7-1	阳性 Positive
转基因玉米 Transgenic maize	BT11； 59112； MON863	阴性 Negative
转基因油菜 Transgenic rapeseed	RF1	阴性 Negative
转基因水稻 Transgenic rice	KMD	阴性 Negative

表2 RPA引物

Table 2 RPA primers

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequences （5’-3’）	扩增产物大小 Amplification product length/bp	GenBank ID
RPA-CP4-1-F	CCAATCACCTACAGGGTACCTATGGCTTCCGCTCA	172	KJ701163
RPA-CP4-1-R	CAGCATCAGTCTCAACGGTAAGGTTAGCACCAAAA	172	KJ701163
RPA-CP4-2-F	CACTGAAAAGATGCTTCAAGGTTTTGGTGCTAACC	150
RPA-CP4-2-R	AATGGGAAAGCAGTAGAGGATGGATCACCTGGAAC	150
RPA-CP4-3-F	TCAACACCCCAGGTATCACCACTGTTATCGAGCCA	148
RPA-CP4-3-R	AGCTTACCACGACCTTCAAGACGGATGGTACGCAC	148
RPA-CP4-4-F	CAATCACCTACAGGGTACCTATGGCTTCCGCTC	167
RPA-CP4-4-R	ATCAGTCTCAACGGTAAGGTTAGCACCAAAA	167
RPA-CP4-5-F	TCTCAACACCCCAGGTATCACCACTGTTATCGAGC	204	AF464188
RPA-CP4-5-R	CAGCAACCAATGGGAAAGCAGTAGAGGATGGATCA	204	AF464188

表3 RPA体系优化

Table 3 RPA system optimization

成分Ingredient	反应体积 Reaction volume/μL
成分Ingredient	50	25	20	15
Buffer	29.50	14.75	11.80	8.85
Primer-F	2.40	1.20	1.00	0.70
Primer-R	2.40	1.20	1.00	0.70
DNA	2.00	1.00	0.80	0.60
ddH₂O	11.20	5.60	4.20	3.40
MgOAC	2.50	1.25	1.00	0.75

图1 RPA-CP4-1～RPA-CP4-5的扩增产物注：1～5分别为引物RPA-CP4-1～RPA-CP4-5；6为空白对照；M为2 000的maker。

Fig. 1 Amplification products of RPA-CP4-1～RPA-CP4-5Note：1～5 represent the amplified bands of RPA primers RPA-CP4-1～RPA-CP4-5， respectively； 6 represents the blank control； M is the maker of 2 000.

图2 不同体积反应体系的扩增产物注：1～4分别表示体系为50、25、20 和15 μL。

Fig. 2 Amplification products of different reaction systemNote：1～4 indicate that the system of 50， 25， 20 and 15 μL， respectively.

图3 不同反应温度的扩增产物注：1～8分别表示温度35、36、37、38、39、40、41、42 ℃；9空白对照；M为1 000的maker。

Fig. 3 Amplification products of different reaction temperaturesNote：1～8 represent the maker with temperature 35， 36， 37， 38， 39， 40， 41， 42 ℃； 9 is blank control， M is the maker of 1 000.

图4 RPA特异性检测注：1—2~9的DNA混合样品；2—转基因玉米BT-11；3—转基因水稻KMD；4—转基因玉米59112；5—转基因玉米MON863；6—转基因油菜RF1；7—非转基因大豆；8—非转基因玉米；9—转基因大豆MON88913。

Fig. 4 RPA specificity detectionNote：1—Mixture of 2~9； 2—Genetically modified corn BT-11； 3—Genetically modified rice KMD； 4—Genetically modified corn 59112； 5—Genetically modified corn MON863； 6—Genetically modified rape RF1； 7—Non-transgenic soybean； 8—Non-transgenic corn； 9—Genetically modified soybean MON88913.

图5 RPA灵敏度检测注：1—4.5×107；2—4.5×106；3—4.5×105；4—4.5×104；5—4.5×103；6—4.5×102；7—4.5×101；8—4.5×100；9—空白对照。

Fig. 5 RPA sensitivity detectionNote：1—4.5×107； 2—4.5×106； 3—4.5×105； 4—4.5×104； 5—4.5×103； 6—4.5×102； 7—4.5×101； 8—4.5×100； 9—Blank control.

图6 转基因制品检测注：1—空白对照；2—转基因苜蓿J101；3—转基因甜菜H7-1；4—转基因油菜GT73；5—转基因棉花MON88913；6—转基因棉花MON1445；7—转基因苜蓿J163；8—转基因大豆MON89788；9—转基因玉米NK603。

Fig. 6 Detection of genetically modified productsNote：1—Blank control； 2—Transgenic alfalfa J101； 3—Transgenic sugar beet H7-1； 4—Transgenic rape GT73； 5—Transgenic cotton MON88913； 6—Transgenic cotton MON1445； 7—Transgenic alfalfa J163； 8—Transgenic Soybean MON89788； 9—Transgenic corn NK603.

表4 核酸检测方法比较

Table 4 Comparison of nucleic acid detection methods

分析方法 Analytical method	检测靶标 Detection target	灵敏度Sensitivity	时间 Time/min	使用条件 Conditions required	参考文献Reference
重组酶聚合酶扩增 RPA	CP4-EPSPS	高High	15	Laboratory 实验室	［23］
聚合酶链反应 PCR	PAT， BAR， Cry1Ab/Ac， p35s， tNOS， CTP2-EPSPS	高High	90	Laboratory 实验室	［24］
数字多聚酶链式反应 Digital PCR	MON87705， MON87769， DP356043	高High	90	Laboratory 实验室	［25］
环介导等温扩增 LAMP	CP4-EPSPS	高High	60	Laboratory 实验室	［12］
酶联免疫反应 ELISA	Cry1	高High	120	Laboratory 实验室	［26］
电化学免疫传感器Electrochemical immunosensor	CP4-EPSPS	高High	120	Laboratory 实验室	［27］
实时荧光定量 qPCR	CP4-EPSPS	高High	90	Laboratory 实验室	［24］

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Rapid Detection of CP4-EPSPS Transgenic Products Based on RPA Technology

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